人工瘤胃技术评定饲料营养价值研究进展

饲料营养价值的正确评定是开展动物营养学研究和指导实际生产的基础，主要包括两大部分，一是饲料营养成分的测定，二是各营养成分可利用率评定。在饲料营养成分测定上，虽然康奈尔净碳水化合物和蛋白质体系（Cornell NetCarbohydrate and Protein System，CNCPS）打破传统瘤胃“黑箱”，把饲料养分和瘤胃发酵直接联系起来，但由于检测手段较为繁琐且缺乏大量数据支持检测结果与体内利用率的直接关系，目前尚未在我国推广开来，国内现在绝大多数营养学实验室和生产企业仍然沿用Hennebery和Stohmann于1862年在Weende实验站提出的概略养分分析结合Van Soest提出的纤维分析法对饲料营养成分进行测定。在营养成分可利用率的评定上，常用方法包括体内法，尼龙袋法（半体内法）和人工瘤胃技术（体外法），近年来由于人工瘤胃技术的发展与自身具有的优势，现已逐渐成为应用最为广泛的方法。以下对国内外目前用于评定饲料营养价值的人工瘤胃技术作一综述。

反刍动物瘤胃是一个动态发酵罐，饲料、唾液和水不断流入瘤胃，饲料营养成分在瘤胃中被微生物发酵、转化，同时发酵产物被瘤胃上皮吸收或从瘤胃中流出，进入后部消化道。根据瘤胃发酵的特点，使用仪器设备在体外模拟瘤胃的发酵条件，这样的模拟装置称之为人工瘤胃或瘤胃模拟技术（rumensimulation technique，RUSITEC）。

早期的人工瘤胃技术主要应用于较简单的研究目的，这一时期的发酵装置也比较简单，不少装置仅是在厌氧的条件下对瘤胃液进行了简单的培养。20世纪50~60年代，人工瘤胃技术在牧草有机物和纤维素瘤胃降解研究方面得到了大量应用，这一阶段的人工瘤胃装置趋于复杂，更接近瘤胃发酵的真实情况。至20世纪70年代，随着蛋白质营养研究的深入，人工瘤胃技术开始应用于饲料蛋白质的瘤胃降解率评定。80年代后期，人工瘤胃技术的应用范围扩展到研究营养物质对瘤胃微生物合成量的影响及营养物质的匹配关系，这一时期发展的人工瘤胃装置以可控性持续动态发酵的模拟装置为主，我国代表的装置有中国农业大学自行研制的RSI~II型瘤胃持续动态模拟装置。

至今，人工瘤胃技术发展比较成熟，应用十分广泛，涉及营养学、微生物学、环境科学等多个学科领域。人工瘤胃的类型也很多，根据研究目的总体上可分为短期发酵人工瘤胃和长期发酵人工瘤胃两大类。就评定饲料营养价值方面，短期发酵人工瘤胃的应用更为广泛。

短期发酵人工瘤胃装置的共同特点是静态发酵，不对产物和底物进行分离，因此只能持续较短的时间。但试验装置简单、容易标准化、重复性好，在饲料营养价值评定等研究方面具有很大的价值。

反刍动物的消化过程主要包括两个步骤：第一步是瘤胃消化，在瘤胃微生物的作用下进行；第二步是真胃消化，主要在胃蛋白酶的作用下进行。Tilley和Terry就是在此基础上建立了两步法（两阶段培养法），首先使用离心管培养瘤胃液和饲料样品培养48小时，再使用胃蛋白酶消化48小时，消化结束后分离残渣进行分析。与其他技术不同的是，该方法不仅模拟了瘤胃消化，而且同时模拟了真胃及部分小肠的消化过程，在所有体外法中最具有代表性，自建立以来在欧美国家应用广泛，是评定反刍动物饲料消化率的最常见方法。

Monson等报道了体内尼龙袋法与两步法在检测一些粗饲料时表现的高度相关性（R=0.81）。Van Soest认为Tilley和Terry最初的两步法步骤繁琐，试验周期过长，可能对试验重复性有影响。因此，不少学者先后对两步法做了改进，缩短了试验周期，简化了试验步骤。在国内，不少研究人员先后采用两步法测定干物质、有机物及蛋白质的瘤胃降解率，均取得较好效果。

两步法在评定饲料蛋白质可消化性上具有明显优势，尤其是对于过瘤胃可利用蛋白含量较高的饲料，如DDGS，酒糟等发酵饲料，这类饲料蛋白不易被瘤胃微生物利用，但能被机体很好的吸收，若只使用尼龙带法或其他体外法则不能客观地评价其营养价值。此外，虽然两步法克服了常规试验方法的许多限制因素，但不能反应饲料的动态降解信息，在一定程度上不利于饲料的筛选，加上短期发酵人工瘤胃技术不能外排发酵终产物的特点，可能会影响测定的准确性，这要求两步法需要有好的重复性并且使用体内法获得的数据进行校正。

酶解法指的是使用酶溶液对饲料营养价值进行评定的一种体外方法，与两步法最大的不同在于不使用瘤胃液，从而从根本上摆脱了对瘘管动物的依赖。多使用商业生物酶制剂（蛋白酶、纤维素酶等）与饲料样品混合培养以评定有机物或蛋白质降解率，目前主要有单一胃蛋白酶解法、单一纤维素酶解法和纤维素酶—蛋白酶复合酶解法。

在Tilley和Terry建立两步法之后，有学者使用纤维素酶替代变异较大的瘤胃液对其进行改进，取得了很好的效果。Krishnamoorthy等采用牛链球菌中提取的蛋白酶作为测定蛋白消化率的酶类测得不溶性氮与体内法测得的结果之间存在一定的相关性（R=0.78）。在酶制剂的选择上，一些学者认为，如果不使用来自瘤胃的胃蛋白酶，其对饲料蛋白的活性可能有较大差异，从而导致结果偏差较大。我国颜品勋等使用胃蛋白酶测定多种饲料蛋白降解规律，以尼龙袋法做对照，取得较好的效果，从试验结果可以看出，若将粗饲料进一步分类，可进一步提高酶解法与尼龙带法的相关性。

酶解法优点在于易于标准化，稳定性高，实验室间可比性强，能大批量操作，成本低，不必维持实验动物。但酶解法更适用于比较不同饲料之间的相对差异而不是用于评定体内消化率，其对能量含量高的饲料可能优于尼龙袋法，但对粗饲料测定的重复性较差。

利用人工唾液稀释的新鲜牛粪或羊粪作为菌源替代瘤胃液测定饲料营养成分体外消化率的方法称为粪液法。反刍动物的大肠内容物和排泄物中含有许多瘤胃微生物，如瘤胃乳酸杆菌、瘤胃球菌、牛链球菌、反刍真细菌和梭杆菌等，这些微生物在一定程度上逃避了消化酶的作用而存活下来，并以大肠内的食物残渣作为发酵底物生长和繁殖。这些存在于粪便中的活性瘤胃微生物构成了粪液对饲料消化能力的基础。

Balfe观察到羊粪液可以消化滤纸后，在她的毕业课题中使用粪液替代两步法中的瘤胃液测定了四种牧草的消化率，发现其结果与体内法结果之间存在高度相关性（R=0.93）。Puw采用马和牛的粪便作为菌源替代两步法中的瘤胃液同样证明了牛粪液对饲草具有消化能力。我国20世纪90年代以来，也有不少学者对粪液法做了相关的研究，苗志虹等采用羊粪替代两步法中的瘤胃液测定了不同饲草的干物质消化率，并对测定时的最适称样量和粪液加入量做了研究。张永根等采用粪液法和尼龙袋法对29种牧草做了有机物与蛋白质降解率的比较研究，发现两者之间存在极显著的相关关系（P＜0.01）。

尽管饲料品种对粪液细菌活性有一定的影响，但这种影响要远小于对瘤胃液的影响，这可能与粪液中微生物的组分和活性有一定的关系。总体上来说，粪液法具有简单、重复性好、适合大批量测定等优点，和酶解法相同，粪液法更适合不同饲料间消化率差异的比较，在养殖现场或放牧条件下批量检测粗饲料消化率比较有潜力。但目前不同学者使用的粪液法有所差异，并且有学者认为粪液法并不适合测定秸秆类低质粗饲料，因此在适用范围和标准化上有待进一步研究。

溶解度法是指通过测定饲料营养成分（主要是蛋白和碳水化合物）在缓冲液中的溶解度来评定饲料消化率的方法。

测定可溶性氮的常用缓冲液包括，热蒸馏水、硼酸—磷酸盐溶液，70%乙醇、氯化钠溶液、McDougal人工唾液、Burrough缓冲液和热压处理瘤胃液。测定可溶性碳水化合物所常用的方法有，首先使用热水提取或酸水解提取可溶性碳水化合物，再通过与铁氰化物反应定量。

溶解度法不能将饲料的缓冲液溶解度与瘤胃消化率有效结合起来，其检测结果受到饲料自身蛋白和碳水化合物组成、溶剂化学组成、离子浓度、pH值等多方面影响，应用受到限制。除法国饲料蛋白评估体系采用溶解度法估测常用饲料蛋白的降解程度外，溶解度法在其他地区使用较少。

体外产气法是用于评定反刍动物饲料营养价值非常有效的方法，通过饲料样品在体外用瘤胃液发酵所产生气体(CO₂和CH₄)的速率和含量来估计饲料营养价值，可以评定饲料的有机物和干物质降解率、估测代谢能、监测饲料的动态降解特性及饲料间的组合效应。

早在1884年，瘤胃发酵与产气量之间的关系就被人们所认识到，但瘤胃发酵气体测量技术从上世纪40年代才逐渐开始出现。直到德国霍恩海姆大学动物营养研究所Menke等发现体外发酵产气量与体内表观消化率之间呈高度相关后，体外产气法才得到动物营养学家的重视，此后广泛应用于饲料营养价值评定。

产气法的发展与产气设备密切相关。最初的产气记录设备十分简单，多采用针口密封的有刻度的注射器，通过产气推动活塞来观察产气量。随后压力传感装置被应用到产气量测定上，Pell和Schofield借助压力传感器测定产气瓶的压力，再通过软件转换成大气压下的产气量，取得了很好的效果。之后，手动型产气定点测定装置，半自动产气定点实时记录系统和全自动发酵产气实时记录装置相继出现，体外产气法在营养学研究上得到广泛应用。我国20世纪90年代以来，在体外产气法研究和应用上进行了大量实践，取得了一定的成果，其中最具有代表性的是中国农业大学反刍动物营养研究室自助研发的AGRS型微生物体外发酵产气实时记录系统（国家发明专利授权号：ZL200610011301.X）。

目前，体外产气法不仅用于饲料的营养价值评定，在评价饲料组合效应，预测动物采食量，测定甲烷排放量和研究人及其他单胃动物营养中均有广泛应用。更有学者将体外产气法与高通量等分子生物学技术结合起来开展瘤胃微生物菌群结构变化等机理研究。不过，虽然体外产气法能较真实地模拟瘤胃环境、操作简便、重复性好，具有很高的应用价值，但其本身仍属于短期发酵人工瘤胃，内容物不能外移，发酵终产物积累会使得瘤胃微生物生存环境发生变化，从而在一定程度上对结果的准确性造成影响。此外，在使用产气法评定饲料营养价值时值得注意，因为体外产气量与饲料碳水化合物的消化高度相关，而与饲料蛋白的关系并不密切，所以不能单纯地使用产气量来衡量饲料的营养价值，尤其是对于蛋白含量高的饲料，需要将产气量与干物质消失率、挥发性脂肪酸和微生物蛋白产量结合起来，才能准确全面地评估饲料的营养价值。

长期发酵人工瘤胃的结构比较复杂，能最大限度地模仿瘤胃的特点，可用于常规饲料营养价值评定、蛋白质饲料瘤胃保护技术、各种化学试剂和药物对微生物代谢的影响及瘤胃营养调控等方面的研究。长期发酵人工瘤胃与短期发酵人工瘤胃最大的不同在于，发酵基质和人工唾液不断流入发酵容器，发酵产物和发酵液也不断流出，使人工瘤胃发酵处于动态平衡中，培养时间可长达数周或数月。

从Czerkawski等提出长期发酵人工瘤胃技术并设计了长期发酵人工瘤胃至今，较为成功的长期发酵人工瘤胃有Czerkawski和Breckenridge建立的Rusitec装置，Hoover研制的CC装置，我国相继研发的瘤胃持续模拟装置（RSI）和双外流连续培养系统（CCS）。最初的人工瘤胃是单外流系统，即食糜固相和液相均以相同速度外流。Slyter和Putnam认为，与真实瘤胃内环境相比，在饲喂相同日粮的条件下这种人工瘤胃的原虫数目偏低，细菌数量偏高。在上述四种人工瘤胃中，除Rusitec装置外，其余三种都是双外流系统，即对食糜固相和液相外流速度分别加以控制。双外流系统更接近瘤胃发酵的真实情况。

长期发酵人工瘤胃具有短期发酵人工瘤胃不可比拟的优越性，将长期发酵人工瘤胃单纯用于饲料营养价值评定的研究比较少见，多用于研究反刍动物瘤胃生理学、发酵生物化学等机理研究，也用于部分特殊饲料的评价。近年来，国内外使用长期发酵人工瘤胃开展的研究多集中在不同矿物质、非蛋白氮及其他非常规添加剂对瘤胃发酵的影响。