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摘要：消化能值是评定饲料能量生物学效的主要指标之一。客观精准地评定饲料的消化能值是确定动物营养需要量及优化饲料配方的主要决策依据。本文主要介绍了体外酶法的研究进展，影响评定准确性的因素以及体外酶法评定饲料消化能中存在的一些难题。
关键词：猪;消化能;体外酶法
引言
能量是饲料营养物质的第一要素。代谢能值是评定饲料能量生物学效的主要指标之一，因此，客观精准地评定饲料的代谢能值是确定动物营养需要量及优化饲料配方的主要决策依据。目前评定饲料营养价值的方法主要有体内法、半体内法(运动尼龙袋法)和体外法(酶法)。体内法和半体内法评定饲料营养物质在小肠消化率虽然较为客观实际，但都需要依赖于试验动物，半体内法还需要借助于必要的瘘管手术和试验设备，试验较麻烦且费用昂贵，不适于生产实际，而酶法是利用一种或多种酶或动物小肠液模拟动物体内的环境，在体外对营养物质进行消化，以评定营养物质的消化率，是一种快速且相对准确的试验方法。
酶法最早产生于50年代，最初只是用单一胃蛋白酶法评定饲料蛋白质的消化率，虽然这一方法快速简便，但与体内法所测数据相差较大(Grand 和Carroll,1958; Campbell,1961)。Akeson和Stahmann(1964)进一步发展了酶法，在胃蛋白酶的基础上又加入了胰蛋白酶，测得真蛋白消化率与体内法所测数据强烈相关(r=0.995)，使得胃蛋白酶加胰蛋白酶法成为评定单胃动物饲料蛋白质消化率的常规方法, 但这种方法是在假定蛋白消化率不受其他养分消化影响的基础上建立的，而消化道酶谱是一个复杂多变的多酶系统，由于各种酶元所需要的激活条件不同以及酶作用于底物的反馈抑制作用。所以胃蛋白酶加胰蛋白酶法并不能真正反映体内消化过程。日本Furuya(1974)提出了胃蛋白酶加小肠液测定离体消化试验方法，通过离体法和全收粪二者比较,两法干物质和能量消化率间均为强相关，且测值相当一致。国内张子仪等(1981-1988)对此法做了进一步研究，已形成一套完整的实验室测定猪饲料营养物质消化率的体外方法。
国内外研究现状分析
自Kuhn (1894)首创用能量直接衡量饲料营养以来，饲料有效能值的评定已经历了一个多世纪。猪消化能值的研究也是伴随着研究方法的改进而不断发展，饲养试验和代谢试验等生物学法是评定饲料有效能值较为科学、合理的一种试验方法，但这些方法往往耗时、费力，很难在短时间内对大量的饲料样品进行评价、分析且不宜标准化。因此，有必要寻求一种快速、准确、简便、经济的评定方法。长期以来，各国营养学家试图通过酶水解法建立一种快速测定饲料能量生物学效价的方法，但这种方法一直处于实验室阶段而未应用于生产，其主要原因就在于未解决方法的标准化问题，实质上是消化酶的标准化问题，即酶的活性和种类。众所周知，饲料主要在猪的小肠中消化，而猪的胰腺及肠道内的消化酶活性并非怛定的，若以胰腺或小肠液作为酶法的消化酶来源，则因消化酶活性的变异较大而无法解决标准化问题，因此，根据猪小肠的酶解特性来建立与之等效的模拟肠液及仿生消化方法将为猪饲料代谢能值的酶法定量测定技术解决重大技术难题，对提高我国猪的生产水平，节约饲料资源以及减少排泄物对环境的污染有重要的社会和经济效益。
1酶法评定方法
随着20世纪30年代胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶结晶的析出及随后的各种消化酶测定方法的发展，许多学者将离体消化的模拟模型定格到了由一种或儿种关键酶分步降解的离体反应模型，并进行了一系列研究，提出了一步酶解法与多步酶解法(张铁鹰，2002)。
1.1一步酶解法
一步酶解法主要是根据蛋白质在蛋白酶的作用下肽键断裂，由蛋白质的水解程度来判断蛋白质品质及其在体内的消化率(Sheffner等1956; Taverner和Farrell， 1981; Hewitt等1985; Meer等1990)或由解离出的氢离子导致溶液pH值降低的幅度和蛋白质体内消化率之间建立回归方程，预测体内蛋白质的消化率( Maga等, 1973; Hsu等, 1977 )，但预测的精确度可能会受到多种因素的影响，特别是饲料样品中矿物质缓冲能力的影响。为此，Pedersen和Eggum等(1983)对其进行了改进，即用NaOH不断中和蛋白质水解过程产生的氢离子，使PH值保持不变。此方法虽然简单、快速，但考虑的因素较单一。由于抗营养因子、热处理及饲料物理性状的影响，测定结果与生物学法的相关性很低，且仅限于对饲料蛋白质消化率进行评价和预测，不适合对其它营养成分进行评定。
1.2多步酶解法
饲料养分在动物体内的消化过程是由物理消化与多种消化酶共同参与下完成的，只有充分考虑养分在体内消化的各种关键因素，不断改进对消化道内各种环境条件的模拟，才能使预测结果更科学。随着畜禽消化生理学及酶学的发展，单胃动物体外消化模拟技术也得到了发展，已由过去的单一酶法发展为现在的多酶法。多酶法不但对胃消化过程进行模拟，而且还对胰腺分泌消化酶、小肠消化以及大肠微生物消化等过程进行模拟，即由儿种消化酶同时完成畜禽体内消化过程。根据后段消化道模拟部位的不同，多酶法可简单分为胃-小肠两步法和胃-小肠-大肠三步法。
1.2.1胃-小肠两步法
Buchmann等(1979)使用胃蛋白酶一胰酶来预测蛋白质的体内消化率，利用该方法所测定30种大麦蛋白体外消化率与大鼠体内消化率存在很强的相关性。其后，Boisen等(1991) , Boisen和Fernandez等(1995)主要针对此方法中降解物与未降解物的分离方法进行了研究并提出了修改方案。修订后的方案所测饲料干物质、有机物、蛋白质、能量的消化率与生物学法均存在强相关关系。但此方法中，消化产物不断积累会对酶促反应产生抑制作用，从而导致体外养分消化率降低，影响其预测体内养分消化率的准确性。此外，此方法中用三氯乙酸或磺基水杨酸溶液来沉淀反应液中未被降解但溶于水的蛋白质，然而淀粉和脂肪的消化产物并不能简单地以三氯乙酸或磺基水杨酸来分离。同时，一些可以被动物吸收的小肽也被人为的划分为未被消化蛋白。为此，一些学者为了克服消化产物累积对酶促反应的抑制作用，建立了以透析为手段去除消化产物的方法并对消化酶的浓度、饲料粒度、透析时间、透析袋截留分子量大小、透析液流速及酶促反应温度等因素进行了一些研究，得出透析法与生物学法的相关性比未去除产物法更高的结论，并提出了几套体外消化模拟操作规程(Cave等> 1988;Gauthier等，1982; Savoie和Gauthier, 1986; Drake,1991;黄瑞林等，1999;张铁鹰等，2002)。
这些方法所采用的透析袋截留分子量为1OOODa, 恰好能够使氨基酸和部分小肽通过，这与蛋白质在体内的实际吸收情况比较接近。因此，其在预测蛋白质的体内消化率上比未去除产物方法更合理。然而透析袋的孔径主要针对蛋白质的降解产物，并不能改善对饲料有效能及其它养分消化率的预测值。畜禽采食的饲料经过胃初步消化后，通过胃运动分批转运到下一段消化道(十二指肠)。因此，如果利用猪小肠液测定饲料体外消化率，除胰蛋白酶、糜蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等主要消化酶外，胰脏分泌的微量物质、肝脏分泌物及肠肽酶等一些影响养分消化的成分均可通过猪小肠液来获得。这样可以使体外消化模拟过程与体内更接近，所测定结果也更可靠合理。中国农科院畜牧研究所在20世纪80年代对该方法进行了系统的研究和改进，建立了一套标准化的操作程序，利用该方法测定的饲料干物质和能量体外消化率与生物学法间存在强相关(R2=0.95 0.98).
1.2.3胃-小肠-大肠三步法
一步及两步酶解法主要模拟了胃或胃与小肠的消化，并没有考虑回肠以后微生物的作用，而猪后段消化道微生物发酵产生的挥发性脂肪酸所提供的能量大约占日粮中提供能量的12%(Kass 等, 1980)。以这些方法来预测养分的表观消化率及有效能时存在一定的局限。Fonty和Goue(1989)及Ahrens等(1991)发现，瘤胃微生物与猪大肠内微生物的组成和发酵原理存在许多共同之处，为此，一些学者提出了胃蛋白酶一胰酶一瘤胃液(Fonty和Gouet, 1989)及胃蛋白酶一胰酶一碳水化合物酶三步酶解法，并建立了操作规程(Metz和VanderMeer, 1985; Boisen和Fernandez, 1994,1997)。瘤胃液法与碳水化合物酶法相比消化处理所用时间长，受瘤胃液的来源影响较大;而碳水化合物酶是一种商品，组分稳定，而且消化处理所用时间也较短。Boisen和Fernandez(1997)利用碳水化合物酶法测定的90个饲料样品和31种配合饲料的体外有机物质消化率与体内能量消化率之间存在线性相关(RZ=0.94)，这表明利用胃蛋白酶一胰酶一碳水化合物酶三步酶解法能够较好地预测单胃动物饲料的消化能。
2影响酶法评定效果的因素
2.1动物品种及小肠部位的影响
陈雪秀等(1984)研究了用不同品种猪(杜北、长枫、北京黑)小肠液测得离体消化率
的比较，结果表明，北京黑猪的小肠液的淀粉酶和胰蛋白酶活均高于杜北，用杜北猪小肠液测出的离体干物质消化率及能量消化率在测定低蛋白日粮时与长枫、北京黑猪无差异，应用杜北猪小肠液测定高蛋白日粮时其离体能量消化率比北京黑猪小肠液的测值低(P<0.05)。
研究表明小肠液的酶活与小肠的部位有关，(Toofanian等，1973;iddons,1968;Russell等，1981)，因而从小肠不同部位采集的小肠液酶活不同，所测得的营养物质离体消化率可能不同。Keys等(1974)报道，饲料中的养分在小肠各部位的消化率有很大差异，在小肠上部的有机表观消化率为29.8%，而在小肠中下部达65.9%。陈雪秀等(1984)研究表明，用距幽门50cm处采集的猪前瘘小肠液处理的离体消化率与常法相差较大，如干物质消化率比常法低4.7%-5.1%，能量消化率低6.5-8%，而用距幽门170cm处采集的后瘘小肠液的测值与常法相近。
2.2不同日粮营养水平对小肠液的影响
动物日粮水平影响小肠消化酶的活性(Clary等，1969;Van Hellen等1978; Russell等1981;Jahnson等1977; Owens等，1986)。因而用来源于不同日粮类型的小肠液测得的离体消化率可能存在差异。Karrel等(1966)和Owens等(1986)报道，淀粉酶的活性是影响淀粉在小肠消化率的因素之一。王述容等(1981)报道，在采集猪小肠液前连续十天喂给单一饲料-麸皮，然后采集肠液，用此肠液与混合料肠液处理的离体消化率比较，混合料处理的离体干物质消化率比单喂麸皮处理的高7-10%，但蛋白和能量的消化率相差不大。而姜云侠等(1983)研究表明，饲喂不同营养水平日粮(高能量低蛋白日粮和低能量高蛋白日粮)的猪小肠液对离体干物质消化率、粗蛋白质消化率无显著影响。
2.3环境PH及Ca2+的影响
梁皓仪等(1988)报道，猪小肠液冻干粉(PIF )对粗蛋白质的消化率受pH的影响较小，当pH在7.0-8.5范围内，PIF对蛋白质的消化率无大的差异。
2.4小肠液冻干粉的用量与离体消化率的关系
张建中(1997)研究了牛小肠液冻干粉(BIF)的用量对淀粉消化率的影响，研究表明，当BIF用量为0.3克时//0.5克饲料(BIF中淀粉酶的活性为302.18IU/g)，淀粉的消化率趋于稳定，再增加BIF用量，其淀粉消化率变化不大。李建国(1997)就BIF用量对瘤胃非降解蛋白(UDP)消化率的影响进行了研究，结果当小肠液冻干粉用量在12单位//0.5克UDP以上时，UDP的消化率基本稳定，因此，在用小肠液冻干粉测定营养物质的消化率时应选择适当的用月乳。
2.5培养时间对离体消化率的影响
梁皓仪等(1988)分别测定了三种猪日粮经胃蛋白酶一PIF消化3小时和4小时后的粗蛋白消化率，结果表明，不同培养时间对样品粗蛋白的消化率没有影响。王忠生(1994)用胃蛋白酶和BIF结合评定UDP消化率的试验结果为，当把胃蛋白酶的处理时间固定在4小时，延长BIF的培养时间，饲料UDP消化率有增长趋式，但培养时间超过6小时，增长出现停滞现象。张建中(1997)就BIF对淀粉、熟淀粉及瘤胃24小时玉米残渣的离体消化试验表明，对于淀粉和熟淀粉，BIF的培养时间从6小时开始稳定，6小时后各时间点的消化率无显著差异(P>0.05)，玉米和瘤胃24小时玉米残渣的淀粉消化率从7小时后稳定，7小时后各时间点的淀粉消化率差异不显著(P>0.05)，通过以上研究结果可看出，用小肠液冻干粉做离体消化试验时，应根据不同的饲料选择不同的培养时间。
2.6小肠液冻干粉不同加工条件及不同保存条件对离体消化率的影响
张蔚云等(1984-1985)对不同加工工艺及不同保存条件下的PIF的胰蛋白酶活，离体干物质消化率，离体能量消化率进行了效价检验，结果表明，不同加工和保存条件下(小肠液一次解冻与二次解冻;冻干后的PIF抽真空保存与不抽真空保存：抽真空保存的PIF分别贮存于室温和0℃冰箱中)，PIF的胰蛋白酶活性基本上无显著变化((P>0.05);在加工前的PIF原料不论是二次解冻还是一次解冻，贮存时无论抽真空还是不抽真空，只要保存在25℃以下，至少可保持3个月效价稳定不变。但当温度超过25℃时，PIF冻干粉效价有下降趋势。
3，目前存在的难题
离体评定方法从操作的简便性和模拟结果的科学合理性方面均有很大发展，但仍然存在许多不足之处。首先，消化模型中各项消化参数只是部分与体内实际情况相吻合，而有些参数则相差较远，需要继续完善和发展。其次，多数消化模型没有考虑到日龄对动物体内能量消化率的影响，不能对饲料能量在不同生长阶段的畜禽体内的消化率进行准确预测，尤其是仔猪等生长速度较快的动物。由此可见，用离体法预测饲料有效能值方法的研究仍任重道远。
